Methylation-specipc PCR (MSP) Kit

ชุดตรวจจับ PCR เฉพาะเมทิลเลชั่น

ชุด PCR เฉพาะเมทิลเลชั่น (MSP) ได้รับการพัฒนาเป็นพิเศษสำหรับลูกค้าที่ศึกษาลักษณะเมทิลเลชันของ DNA จีโนมโดย PCR ซึ่ง MSP DNA Polymerase เป็นพอลิเมอเรสที่ทนความร้อนซึ่งดัดแปลงด้วยแอนติบอดี และบัฟเฟอร์ PCR ขนาด 10×MSP เป็นบัฟเฟอร์ PCR ที่ปรับให้เหมาะสมโดยเฉพาะสำหรับ ปฏิกิริยาของ MSP เข้ากันได้กับ TIANGEN DNA Bisulfite Conversion Kit (4992447)

แมว. เลขที่ ขนาดบรรจุ
4992759 50 การเตรียมการ

รายละเอียดผลิตภัณฑ์

เวิร์กโฟลว์

ตัวอย่างการทดลอง

คำถามที่พบบ่อย

แท็กสินค้า

คุณสมบัติ

■ ผลิตภัณฑ์มีข้อดีคือ ความรวดเร็ว ความเรียบง่าย ความไวสูง ความจำเพาะที่แข็งแกร่ง และความเสถียรที่ดี

ข้อมูลจำเพาะ

พิมพ์: MSP DNA Polymerase
แม่แบบ: <500 ng
การใช้งาน: เหมาะสำหรับวิธี PCR เฉพาะ methylation (MSP) เพื่อวิเคราะห์ลักษณะ methylation ของ DNA จีโนม

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดสามารถปรับแต่งสำหรับ ODM/OEM สำหรับรายละเอียดกรุณาคลิกบริการที่กำหนดเอง (ODM/OEM)


  • ก่อนหน้า:
  • ต่อไป:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×

    1. Methylation-Specific PCR(MSP) Kit ถูกนำไปใช้เพื่อขยายชิ้นส่วน 400 bp โดยใช้ DNA จีโนมที่บำบัดด้วยไบซัลไฟต์เป็นเทมเพลตที่มีระบบปฏิกิริยา 20 ไมโครลิตร

    Experimental Exampl

    2. การตั้งค่าวงจรปฏิกิริยา PCR

    Experimental Exampl

     

    Experimental Examples 1: ตัวอย่างที่ประมวลผลโดยซัพพลายเออร์ A;
    2: ตัวอย่างที่ประมวลผลโดยซัพพลายเออร์ B;
    3: TIANGEN ได้รับการรักษาตัวอย่าง 4: NTC; ม: D2000
    Experimental Examples 1-6:
    6 ซ้ำ;
    7: ซัพพลายเออร์ A ตัวอย่างที่ประมวลผล;
    8: กทช; Bio2-F/R และ P16- Me-F/R: ไพรเมอร์สำหรับการตรวจจับสองตัว
    ถาม: ไม่มีแถบขยายเสียง

    เทมเพลต A-1

    ■ แม่แบบประกอบด้วยสิ่งเจือปนโปรตีนหรือสารยับยั้ง Taq เป็นต้น —— ทำให้แม่แบบ DNA บริสุทธิ์ ขจัดสิ่งเจือปนของโปรตีน หรือแยก DNA แม่แบบด้วยชุดการทำให้บริสุทธิ์

    ■ การเปลี่ยนสภาพของแม่แบบไม่สมบูรณ์ —— เพิ่มอุณหภูมิการเสื่อมสภาพอย่างเหมาะสมและยืดเวลาการเสื่อมสภาพให้นานขึ้น

    ■ การลดขนาดเทมเพลต —— เตรียมเทมเพลตอีกครั้ง

    A-2 ไพรเมอร์

    ■ ไพรเมอร์คุณภาพต่ำ —— สังเคราะห์ไพรเมอร์อีกครั้ง

    ■ การเสื่อมสภาพของไพรเมอร์ —— แบ่งไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้นสูงเป็นปริมาตรเล็กๆ เพื่อถนอมอาหาร หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายหลายครั้งหรือแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4°C ในระยะยาว

    ■ การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม (เช่น ความยาวไพรเมอร์ไม่เพียงพอ มีไดเมอร์เกิดขึ้นระหว่างไพรเมอร์ เป็นต้น) -ออกแบบไพรเมอร์ใหม่ (หลีกเลี่ยงการก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์และโครงสร้างรอง)

    A-3 มก.2+ความเข้มข้น

    ■ มก2+ ความเข้มข้นต่ำเกินไป —— เพิ่ม Mg . อย่างเหมาะสม2+ ความเข้มข้น: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    A-4 อุณหภูมิการหลอม

    ■ อุณหภูมิการหลอมที่สูงส่งผลต่อการยึดเกาะของสีรองพื้นและแม่แบบ —— ลดอุณหภูมิการหลอมและปรับสภาพให้เหมาะสมด้วยการไล่ระดับ 2°C

    A-5 ขยายเวลา

    ■ ขยายเวลาสั้น——เพิ่มเวลาขยาย.

    ถาม: ผลบวกลวง

    ปรากฏการณ์: ตัวอย่างเชิงลบยังแสดงแถบลำดับเป้าหมายด้วย

    A-1 การปนเปื้อนของ PCR

    ■ การปนเปื้อนข้ามของลำดับเป้าหมายหรือผลิตภัณฑ์ที่มีการขยายเสียง —— ระวังอย่าปิเปตตัวอย่างที่มีลำดับเป้าหมายในตัวอย่างเชิงลบหรือหกออกจากหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยง น้ำยาหรืออุปกรณ์ควรผ่านการฆ่าเชื้อด้วยไอน้ำเพื่อกำจัดกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ และควรพิจารณาการมีอยู่ของการปนเปื้อนผ่านการทดลองควบคุมเชิงลบ

    ■ การปนเปื้อนรีเอเจนต์ —— แบ่งรีเอเจนต์และเก็บที่อุณหภูมิต่ำ

    A-2 ไพรม์r

    ■ มก2+ ความเข้มข้นต่ำเกินไป —— เพิ่ม Mg . อย่างเหมาะสม2+ ความเข้มข้น: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    ■ การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม และลำดับเป้าหมายมีความคล้ายคลึงกันกับลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมาย ——ออกแบบไพรเมอร์ใหม่

    ถาม: การขยายสัญญาณแบบไม่เฉพาะเจาะจง

    ปรากฏการณ์: แถบขยายสัญญาณ PCR ไม่สอดคล้องกับขนาดที่คาดไว้ ไม่ว่าจะใหญ่หรือเล็ก หรือบางครั้งมีทั้งแถบขยายสัญญาณเฉพาะและแถบขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงเกิดขึ้น

    เอ-1 ไพรเมอร์

    ■ความจำเพาะของไพรเมอร์แย่

    ——ออกแบบไพรเมอร์ใหม่

    ■ ความเข้มข้นของไพรเมอร์สูงเกินไป —— เพิ่มอุณหภูมิการทำให้เสียสภาพอย่างเหมาะสมและยืดเวลาการเสื่อมสภาพให้นานขึ้น

    A-2 มก.2+ ความเข้มข้น

    ■ Mg2+ ความเข้มข้นสูงเกินไป —— ลดความเข้มข้นของ Mg2+ อย่างเหมาะสม: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    A-3 พอลิเมอเรสที่ทนความร้อนได้

    ■ ปริมาณเอนไซม์ที่มากเกินไป —— ลดปริมาณเอนไซม์อย่างเหมาะสมในช่วงเวลา 0.5 U

    A-4 อุณหภูมิการหลอม

    ■ อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป —— เพิ่มอุณหภูมิการหลอมอย่างเหมาะสมหรือใช้วิธีการหลอมแบบสองขั้นตอน

    A-5 PCR รอบ

    ■ รอบ PCR มากเกินไป —— ลดจำนวนรอบ PCR

    ถาม: แถบเป็นหย่อมหรือเปื้อน

    เอ-1 ไพรเมอร์——ความจำเพาะไม่ดี —— ออกแบบไพรเมอร์ใหม่ เปลี่ยนตำแหน่งและความยาวของไพรเมอร์เพื่อเพิ่มความจำเพาะ หรือดำเนินการ PCR ที่ซ้อนกัน

    A-2 แม่แบบ DNA

    —— แม่แบบไม่บริสุทธิ์ —— ทำให้แม่แบบบริสุทธิ์หรือแยก DNA ด้วยชุดการทำให้บริสุทธิ์

    A-3 มก.2+ ความเข้มข้น

    ——Mg2+ ความเข้มข้นสูงเกินไป —— ลด Mg . อย่างเหมาะสม2+ ความเข้มข้น: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    A-4 dNTP

    ——ความเข้มข้นของ dNTP สูงเกินไป —— ลดความเข้มข้นของ dNTP อย่างเหมาะสม

    A-5 อุณหภูมิการหลอม

    —— อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป —— เพิ่มอุณหภูมิการหลอมอย่างเหมาะสม

    A-6 รอบ

    —— รอบมากเกินไป —— ปรับหมายเลขรอบให้เหมาะสม

    ถาม: ควรเพิ่มเทมเพลต DNA เท่าใดในระบบปฏิกิริยา PCR ขนาด 50 ไมโครลิตร
    ytry
    ถาม: จะขยายชิ้นส่วนที่ยาวได้อย่างไร

    ขั้นตอนแรกคือการเลือกพอลิเมอเรสที่เหมาะสม Taq polymerase ปกติไม่สามารถพิสูจน์อักษรได้เนื่องจากขาดกิจกรรม exonuclease 3'-5' และไม่ตรงกันจะลดประสิทธิภาพการขยายของแฟรกเมนต์ลงอย่างมาก ดังนั้น Taq polymerase ปกติจึงไม่สามารถขยายชิ้นส่วนเป้าหมายที่มีขนาดใหญ่กว่า 5 kb ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ควรเลือก Taq polymerase ที่มีการดัดแปลงพิเศษหรือโพลิเมอร์ที่มีความเที่ยงตรงสูงอื่นๆ เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการขยายและตอบสนองความต้องการของการขยายชิ้นส่วนแบบยาว นอกจากนี้ การขยายชิ้นส่วนที่มีความยาวยังต้องการการปรับการออกแบบไพรเมอร์ เวลาการเปลี่ยนสภาพ เวลาในการขยาย ค่า pH ของบัฟเฟอร์ ฯลฯ โดยปกติแล้ว ไพรเมอร์ที่มี 18-24 bp จะทำให้ได้ผลผลิตดีขึ้น เพื่อป้องกันความเสียหายของแม่แบบ ควรลดเวลาในการเปลี่ยนสภาพที่ 94°C เป็น 30 วินาทีหรือน้อยกว่าต่อรอบ และเวลาในการเพิ่มอุณหภูมิเป็น 94°C ก่อนการขยายเสียงควรน้อยกว่า 1 นาที นอกจากนี้ การตั้งอุณหภูมิการขยายที่ประมาณ 68°C และการออกแบบเวลาการขยายตามอัตรา 1 kb/นาที สามารถรับประกันการขยายชิ้นส่วนที่ยาวได้อย่างมีประสิทธิภาพ

    ถาม: จะปรับปรุงความเที่ยงตรงของการขยายสัญญาณของ PCR ได้อย่างไร

    อัตราความผิดพลาดของการขยาย PCR สามารถลดลงได้โดยใช้ DNA polymerase ต่างๆ ที่มีความเที่ยงตรงสูง ในบรรดา Taq DNA polymerase ทั้งหมดที่พบจนถึงตอนนี้ เอนไซม์ Pfu มีอัตราความผิดพลาดต่ำสุดและความเที่ยงตรงสูงสุด (ดูตารางแนบ) นอกจากการเลือกเอนไซม์แล้ว นักวิจัยสามารถลดอัตราการกลายพันธุ์ของ PCR ได้อีกโดยการปรับสภาวะของปฏิกิริยาให้เหมาะสม รวมถึงการเพิ่มประสิทธิภาพองค์ประกอบบัฟเฟอร์ ความเข้มข้นของพอลิเมอเรสที่ทนความร้อนได้ และการปรับหมายเลขรอบ PCR ให้เหมาะสม

    เขียนข้อความของคุณที่นี่และส่งถึงเรา