Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

การกลายพันธุ์แบบไซต์เดียวหรือหลายไซต์อย่างรวดเร็วบนยีนเป้าหมายในเวกเตอร์เป้าหมาย

การกลายพันธุ์ที่ควบคุมโดยไซต์ในหลอดทดลองเป็นวิธีการทดลองที่สำคัญในด้านต่างๆ ของชีววิทยาและการแพทย์ ซึ่งส่วนใหญ่ใช้ในการปรับเปลี่ยนและเพิ่มประสิทธิภาพยีนเป้าหมาย สำรวจไซต์ควบคุมของโปรโมเตอร์ ตลอดจนศึกษาความสัมพันธ์ที่ซับซ้อนระหว่างโครงสร้างโปรตีนและหน้าที่ ชุดเครื่องมือนี้ใช้เทคโนโลยีชั้นนำในปัจจุบันเพื่อดำเนินการการกลายพันธุ์ของไซต์เดียว การกลายพันธุ์หลายไซต์โดยตรง และการกลายพันธุ์ของการแทรกหรือการลบบนยีนเป้าหมายโดยตรง อัตราการกลายพันธุ์ของการกลายพันธุ์ที่ไซต์เดียวสามารถเข้าถึงได้มากกว่า 90% นอกจากนี้ ไม่เหมือนชุดการกลายพันธุ์แบบดั้งเดิมที่ต้องใช้ PCR หลายรอบ การโคลนย่อย และขั้นตอนอื่นๆ ที่ต้องใช้เวลาและแรงงานมาก การทำงานของชุดอุปกรณ์นั้นง่ายกว่า และจำเป็นต้องมีเพียงสี่ขั้นตอนเพื่อสร้างสายพันธุ์กลายพันธุ์

แมว. เลขที่ ขนาดบรรจุ
44992901 20 rxn

 

 


รายละเอียดผลิตภัณฑ์

คำถามที่พบบ่อย

แท็กสินค้า

คุณสมบัติ

■ ง่ายและรวดเร็ว: ชุดนี้ใช้เทคโนโลยีการขยายสัญญาณพลาสมิดแบบทดแทนที่ไม่ใช่เส้นใย ต้องการเพียง 4 ขั้นตอนในการตระหนักถึงการเปลี่ยนแปลงจากสายพันธุ์ไวด์ไปสู่สายพันธุ์กลายพันธุ์ โดยไม่ต้องเสียเวลาและขั้นตอนที่ต้องใช้แรงงานมาก เช่น การทำ PCR หลายรอบและการโคลนย่อย
■ ไพรเมอร์ประสิทธิภาพสูง: ชุดนี้ใช้หลักการออกแบบไพรเมอร์ที่ทับซ้อนกันบางส่วน เพื่อให้สามารถหาพลาสมิดที่กลายพันธุ์ได้มากขึ้นโดยการขยายเสียง
■ ใช้กันอย่างแพร่หลาย: ชุดอุปกรณ์นี้ไม่เพียงแต่ดำเนินการกลายพันธุ์ที่จุดเดียว แต่ยังรวมถึงการกลายพันธุ์แบบหลายจุด สามารถกลายพันธุ์ได้ถึง 5 ไซต์
■ ความสามารถในการปรับตัวที่แข็งแกร่ง: ชุดอุปกรณ์นี้สามารถดำเนินการกลายพันธุ์แบบกำหนดตำแหน่งบนพลาสมิดที่มีขนาดสูงสุด 10 kb ซึ่งโดยทั่วไปจะครอบคลุมพลาสมิดที่ใช้กันทั่วไปทั้งหมด
■ อัตราการกลายพันธุ์สูง: ชุดอุปกรณ์นี้มีฟังก์ชันการย่อยแบบคู่ของเทมเพลตพลาสมิดเมทิลเลตในหลอดทดลองและในร่างกาย ทำให้มั่นใจได้ว่าอัตราการกลายพันธุ์จะสูงขึ้น

การตั้งค่าปฏิกิริยาการกลายพันธุ์ของไซต์และโปรแกรม PCR

■ สำหรับการกลายพันธุ์แบบหลายไซต์ไพรเมอร์เดี่ยว อัตราการกลายพันธุ์จะต่ำกว่าการกลายพันธุ์ของไซต์เดียวเนื่องจากจำนวนไซต์การกลายพันธุ์ที่เพิ่มขึ้น จากข้อมูลการทดลองของเรา เมื่อจำนวนไซต์การกลายพันธุ์ถึง 5 แห่ง อัตราบวกของการกลายพันธุ์จะลดลงเหลือ 50% ดังนั้น ในกรณีนี้ ขอแนะนำให้เพิ่มจำนวนโคลนที่ตรวจสอบแล้ว
■ ชุดนี้สนับสนุนการกลายพันธุ์แบบ multi-primer multi-site mutation เพื่อให้สามารถดำเนินการทดลองการกลายพันธุ์ได้พร้อม ๆ กันในช่วงกว้างของยีน ขีดจำกัดสูงสุดของจำนวนไซต์การกลายพันธุ์ยังคงเป็น 5
■ แนะนำว่าควรใช้พลาสมิดควบคุมและไพรเมอร์ที่ให้มาในชุดคิทเมื่อทำการทดลองการกลายพันธุ์ครั้งใหม่ เพื่ออำนวยความสะดวกในการวิเคราะห์ปัญหาการทดลอง

Fast Site-Directed Mutagenesis Kit Fast Site-Directed Mutagenesis Kit

ผลิตภัณฑ์ทั้งหมดสามารถปรับแต่งสำหรับ ODM/OEM สำหรับรายละเอียดกรุณาคลิกบริการที่กำหนดเอง (ODM/OEM)


  • ก่อนหน้า:
  • ต่อไป:

  • product_certificate04 product_certificate01 product_certificate03 product_certificate02
    ×
    ถาม: ไม่มีแถบขยายเสียง

    เทมเพลต A-1

    ■ แม่แบบประกอบด้วยสิ่งเจือปนโปรตีนหรือสารยับยั้ง Taq เป็นต้น —— ทำให้แม่แบบ DNA บริสุทธิ์ ขจัดสิ่งเจือปนของโปรตีน หรือแยก DNA แม่แบบด้วยชุดการทำให้บริสุทธิ์

    ■ การเปลี่ยนสภาพของแม่แบบไม่สมบูรณ์ —— เพิ่มอุณหภูมิการเสื่อมสภาพอย่างเหมาะสมและยืดเวลาการเสื่อมสภาพให้นานขึ้น

    ■ การลดขนาดเทมเพลต —— เตรียมเทมเพลตอีกครั้ง

    A-2 ไพรเมอร์

    ■ ไพรเมอร์คุณภาพต่ำ —— สังเคราะห์ไพรเมอร์อีกครั้ง

    ■ การเสื่อมสภาพของไพรเมอร์ —— แบ่งไพรเมอร์ที่มีความเข้มข้นสูงเป็นปริมาตรเล็กๆ เพื่อถนอมอาหาร หลีกเลี่ยงการแช่แข็งและละลายหลายครั้งหรือแช่เย็นที่อุณหภูมิ 4°C ในระยะยาว

    ■ การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม (เช่น ความยาวไพรเมอร์ไม่เพียงพอ มีไดเมอร์เกิดขึ้นระหว่างไพรเมอร์ เป็นต้น) -ออกแบบไพรเมอร์ใหม่ (หลีกเลี่ยงการก่อตัวของไพรเมอร์ไดเมอร์และโครงสร้างรอง)

    A-3 มก.2+ความเข้มข้น

    ■ มก2+ ความเข้มข้นต่ำเกินไป —— เพิ่ม Mg . อย่างเหมาะสม2+ ความเข้มข้น: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    A-4 อุณหภูมิการหลอม

    ■ อุณหภูมิการหลอมที่สูงส่งผลต่อการยึดเกาะของสีรองพื้นและแม่แบบ —— ลดอุณหภูมิการหลอมและปรับสภาพให้เหมาะสมด้วยการไล่ระดับ 2°C

    A-5 ขยายเวลา

    ■ ขยายเวลาสั้น——เพิ่มเวลาขยาย.

    ถาม: ผลบวกลวง

    ปรากฏการณ์: ตัวอย่างเชิงลบยังแสดงแถบลำดับเป้าหมายด้วย

    A-1 การปนเปื้อนของ PCR

    ■ การปนเปื้อนข้ามของลำดับเป้าหมายหรือผลิตภัณฑ์ที่มีการขยายเสียง —— ระวังอย่าปิเปตตัวอย่างที่มีลำดับเป้าหมายในตัวอย่างเชิงลบหรือหกออกจากหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยง น้ำยาหรืออุปกรณ์ควรผ่านการฆ่าเชื้อด้วยไอน้ำเพื่อกำจัดกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ และควรพิจารณาการมีอยู่ของการปนเปื้อนผ่านการทดลองควบคุมเชิงลบ

    ■ การปนเปื้อนรีเอเจนต์ —— แบ่งรีเอเจนต์และเก็บที่อุณหภูมิต่ำ

    A-2 ไพรม์r

    ■ มก2+ ความเข้มข้นต่ำเกินไป —— เพิ่ม Mg . อย่างเหมาะสม2+ ความเข้มข้น: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    ■ การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม และลำดับเป้าหมายมีความคล้ายคลึงกันกับลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมาย ——ออกแบบไพรเมอร์ใหม่

    ถาม: การขยายสัญญาณแบบไม่เฉพาะเจาะจง

    ปรากฏการณ์: แถบขยายสัญญาณ PCR ไม่สอดคล้องกับขนาดที่คาดไว้ ไม่ว่าจะใหญ่หรือเล็ก หรือบางครั้งมีทั้งแถบขยายสัญญาณเฉพาะและแถบขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงเกิดขึ้น

    เอ-1 ไพรเมอร์

    ■ความจำเพาะของไพรเมอร์แย่

    ——ออกแบบไพรเมอร์ใหม่

    ■ ความเข้มข้นของไพรเมอร์สูงเกินไป —— เพิ่มอุณหภูมิการทำให้เสียสภาพอย่างเหมาะสมและยืดเวลาการเสื่อมสภาพให้นานขึ้น

    A-2 มก.2+ ความเข้มข้น

    ■ Mg2+ ความเข้มข้นสูงเกินไป —— ลดความเข้มข้นของ Mg2+ อย่างเหมาะสม: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    A-3 พอลิเมอเรสที่ทนความร้อนได้

    ■ ปริมาณเอนไซม์ที่มากเกินไป —— ลดปริมาณเอนไซม์อย่างเหมาะสมในช่วงเวลา 0.5 U

    A-4 อุณหภูมิการหลอม

    ■ อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป —— เพิ่มอุณหภูมิการหลอมอย่างเหมาะสมหรือใช้วิธีการหลอมแบบสองขั้นตอน

    A-5 PCR รอบ

    ■ รอบ PCR มากเกินไป —— ลดจำนวนรอบ PCR

    ถาม: แถบเป็นหย่อมหรือเปื้อน

    เอ-1 ไพรเมอร์——ความจำเพาะไม่ดี —— ออกแบบไพรเมอร์ใหม่ เปลี่ยนตำแหน่งและความยาวของไพรเมอร์เพื่อเพิ่มความจำเพาะ หรือดำเนินการ PCR ที่ซ้อนกัน

    A-2 แม่แบบ DNA

    —— แม่แบบไม่บริสุทธิ์ —— ทำให้แม่แบบบริสุทธิ์หรือแยก DNA ด้วยชุดการทำให้บริสุทธิ์

    A-3 มก.2+ ความเข้มข้น

    ——Mg2+ ความเข้มข้นสูงเกินไป —— ลด Mg . อย่างเหมาะสม2+ ความเข้มข้น: ปรับ Mg . ให้เหมาะสม2+ ความเข้มข้นโดยชุดของปฏิกิริยาตั้งแต่ 1 mM ถึง 3 mM โดยมีช่วงเวลา 0.5 mM เพื่อกำหนด Mg ที่เหมาะสมที่สุด2+ ความเข้มข้นสำหรับแต่ละแม่แบบและไพรเมอร์

    A-4 dNTP

    ——ความเข้มข้นของ dNTP สูงเกินไป —— ลดความเข้มข้นของ dNTP อย่างเหมาะสม

    A-5 อุณหภูมิการหลอม

    —— อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป —— เพิ่มอุณหภูมิการหลอมอย่างเหมาะสม

    A-6 รอบ

    —— รอบมากเกินไป —— ปรับหมายเลขรอบให้เหมาะสม

    ถาม: ควรเพิ่มเทมเพลต DNA เท่าใดในระบบปฏิกิริยา PCR ขนาด 50 ไมโครลิตร
    ytry
    ถาม: จะขยายชิ้นส่วนที่ยาวได้อย่างไร

    ขั้นตอนแรกคือการเลือกพอลิเมอเรสที่เหมาะสม Taq polymerase ปกติไม่สามารถพิสูจน์อักษรได้เนื่องจากขาดกิจกรรม exonuclease 3'-5' และไม่ตรงกันจะลดประสิทธิภาพการขยายของแฟรกเมนต์ลงอย่างมาก ดังนั้น Taq polymerase ปกติจึงไม่สามารถขยายชิ้นส่วนเป้าหมายที่มีขนาดใหญ่กว่า 5 kb ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ควรเลือก Taq polymerase ที่มีการดัดแปลงพิเศษหรือโพลิเมอร์ที่มีความเที่ยงตรงสูงอื่นๆ เพื่อปรับปรุงประสิทธิภาพการขยายและตอบสนองความต้องการของการขยายชิ้นส่วนแบบยาว นอกจากนี้ การขยายชิ้นส่วนที่มีความยาวยังต้องการการปรับการออกแบบไพรเมอร์ เวลาการเปลี่ยนสภาพ เวลาในการขยาย ค่า pH ของบัฟเฟอร์ ฯลฯ โดยปกติแล้ว ไพรเมอร์ที่มี 18-24 bp จะทำให้ได้ผลผลิตดีขึ้น เพื่อป้องกันความเสียหายของแม่แบบ ควรลดเวลาในการเปลี่ยนสภาพที่ 94°C เป็น 30 วินาทีหรือน้อยกว่าต่อรอบ และเวลาในการเพิ่มอุณหภูมิเป็น 94°C ก่อนการขยายเสียงควรน้อยกว่า 1 นาที นอกจากนี้ การตั้งอุณหภูมิการขยายที่ประมาณ 68°C และการออกแบบเวลาการขยายตามอัตรา 1 kb/นาที สามารถรับประกันการขยายชิ้นส่วนที่ยาวได้อย่างมีประสิทธิภาพ

    ถาม: จะปรับปรุงความเที่ยงตรงของการขยายสัญญาณของ PCR ได้อย่างไร

    อัตราความผิดพลาดของการขยาย PCR สามารถลดลงได้โดยใช้ DNA polymerase ต่างๆ ที่มีความเที่ยงตรงสูง ในบรรดา Taq DNA polymerase ทั้งหมดที่พบจนถึงตอนนี้ เอนไซม์ Pfu มีอัตราความผิดพลาดต่ำสุดและความเที่ยงตรงสูงสุด (ดูตารางแนบ) นอกจากการเลือกเอนไซม์แล้ว นักวิจัยสามารถลดอัตราการกลายพันธุ์ของ PCR ได้อีกโดยการปรับสภาวะของปฏิกิริยาให้เหมาะสม รวมถึงการเพิ่มประสิทธิภาพองค์ประกอบบัฟเฟอร์ ความเข้มข้นของพอลิเมอเรสที่ทนความร้อนได้ และการปรับหมายเลขรอบ PCR ให้เหมาะสม

    เขียนข้อความของคุณที่นี่และส่งถึงเรา